QUANTOM Tx™微生物細(xì)胞計(jì)數(shù)儀助力快速菌群定量分析

1 引言

細(xì)菌定量是醫(yī)療健康、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、食品加工及工業(yè)領(lǐng)域的基礎(chǔ)檢測(cè)項(xiàng)目。無(wú)論是益生菌中活性干酪乳桿菌的精準(zhǔn)計(jì)量、疫苗中滅活霍亂弧菌的定量檢測(cè)、污水處理用硫氧化菌的效能評(píng)估，抑或土壤污染監(jiān)測(cè)中的常規(guī)菌群分析，乃至實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)菌懸液的濃度測(cè)定，細(xì)菌計(jì)數(shù)均是關(guān)鍵步驟。本文對(duì)比三種傳統(tǒng)細(xì)菌檢測(cè)方法，并介紹一種快速自動(dòng)化定量解決方案。

1.1 菌落計(jì)數(shù)法

細(xì)菌定量的方法之一是統(tǒng)計(jì)菌落形成單位（CFUs）。這種廣泛使用的方法操作簡(jiǎn)單，能夠很好地反映細(xì)胞的活性情況，并且對(duì)低濃度細(xì)菌也具有很高的靈敏度。然而，該方法依賴于培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，并且僅限于可培養(yǎng)的細(xì)菌，這使得存活但不可培養(yǎng)（VBNC）菌株無(wú)法被檢測(cè)。另一個(gè)主要缺點(diǎn)是該方法通常需要數(shù)天時(shí)間才能得到結(jié)果，而這些結(jié)果也只是估算值。一塊菌落可能來(lái)源于一個(gè)細(xì)胞，也可能來(lái)源于上千個(gè)細(xì)胞。此外，樣本制備過(guò)程因技術(shù)人員的操作差異以及樣本條件的不同而可能存在變動(dòng)。對(duì)于諸如食品或水污染等需要快速響應(yīng)的時(shí)效性問(wèn)題而言，這種耗時(shí)的特點(diǎn)是一個(gè)顯著的缺陷。

1.2 血球計(jì)數(shù)板法

采用Petroff-Hausser或Levy等專用計(jì)數(shù)板直接顯微計(jì)數(shù)，這種細(xì)胞計(jì)數(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)"是一種相對(duì)快速、簡(jiǎn)單的方法，可獲得結(jié)果。然而，該方法操作繁瑣，并且容易受到操作者之間差異的影響。細(xì)菌體積微小，不僅某些物種即使在顯微鏡下難以觀察，同時(shí)還會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌在計(jì)數(shù)腔內(nèi)移動(dòng)，并分布于不同的焦平面上，從而難以評(píng)估和控制每次細(xì)胞復(fù)制時(shí)計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。

1.3 流式細(xì)胞儀

流式細(xì)胞儀被認(rèn)為是確定總細(xì)胞數(shù)和活細(xì)胞數(shù)最為準(zhǔn)確的方法之一。然而，這種方法中操作儀器和分析數(shù)據(jù)都需要廣泛的培訓(xùn)。與菌落計(jì)數(shù)類似，流式細(xì)胞儀的一個(gè)顯著局限性是無(wú)法區(qū)分單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)。每個(gè)粒子均記錄為單一事件，因此，聚集的球菌或鏈狀的桿菌無(wú)法被識(shí)別為單個(gè)細(xì)胞。

1.4 QUANTOM Tx™微生物細(xì)胞計(jì)數(shù)儀

QUANTOM Tx微生物細(xì)胞計(jì)數(shù)儀是一款基于圖像的自動(dòng)化細(xì)胞計(jì)數(shù)設(shè)備，能夠在數(shù)分鐘內(nèi)識(shí)別并計(jì)數(shù)單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞。QUANTOM Tx可自動(dòng)對(duì)熒光染色的細(xì)胞進(jìn)行聚焦、成像和多圖像分析，以高靈敏度和高精確度檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞。其先進(jìn)的細(xì)胞檢測(cè)與解聚算法，即使在最緊密的細(xì)胞聚集體中，也能準(zhǔn)確識(shí)別單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞。通過(guò)使用兩種不同的染料，QUANTOM Tx可以分別計(jì)數(shù)總細(xì)胞數(shù)或活細(xì)胞數(shù)。染色后的細(xì)胞與QUANTOM細(xì)胞加載緩沖液I混合后，被加載到QUANTOM M50細(xì)胞計(jì)數(shù)載片中，并使用QUANTOM離心機(jī)進(jìn)行離心處理，從而將細(xì)胞固定并均勻分布在單一焦平面上，確保精確的細(xì)胞檢測(cè)。計(jì)數(shù)結(jié)果和圖像可在計(jì)數(shù)完成后立即查看和保存。

用QUANTOM Tx™微生物細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)

2 QUANTOM Tx對(duì)標(biāo)準(zhǔn)微球計(jì)數(shù)的精準(zhǔn)測(cè)定

通過(guò)計(jì)數(shù)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)熒光微球，驗(yàn)證了QUANTOM Tx的計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)中，微球經(jīng)系列稀釋后與QUANTOM細(xì)胞加載緩沖液I混合，并加載到QUANTOM M50細(xì)胞計(jì)數(shù)載片中。載片在QUANTOM離心機(jī)中以300×g（RCF）離心10分鐘，以確保微球均勻分布，隨后使用以下參數(shù)在QUANTOM Tx上進(jìn)行計(jì)數(shù)：LED設(shè)置為“Bead（微球）"、粒徑范圍為1-50μm、檢測(cè)靈敏度為0、解聚等級(jí)為7、圓度為30%。所有計(jì)數(shù)均進(jìn)行了三次重復(fù)。正如圖1所示，QUANTOM Tx的計(jì)數(shù)結(jié)果與微球的理論濃度呈現(xiàn)出高度相關(guān)性（R2 = 0.9997）。

圖1. 已知標(biāo)準(zhǔn)微球濃度與QUANTOM Tx結(jié)果之間的相關(guān)性

3 與流式細(xì)胞儀和血球計(jì)數(shù)板的準(zhǔn)確性及變異性比較

為了比較QUANTOM Tx與流式細(xì)胞儀和血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性，對(duì)大腸桿菌進(jìn)行了三次重復(fù)的系列稀釋計(jì)數(shù)。對(duì)于流式細(xì)胞儀，使用噻唑橙（Thiazol Orange）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，并使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀（BD Biosciences）進(jìn)行計(jì)數(shù)，同時(shí)加入標(biāo)準(zhǔn)微球以幫助確定細(xì)胞濃度。對(duì)于血球計(jì)數(shù)板，細(xì)胞被加載到Petroff-Hausser計(jì)數(shù)板（20 μm，Hausser Scientific）中，并通過(guò)CELENA S數(shù)字成像系統(tǒng)（Logos Biosystems）使用TC PlanAchro 20倍物鏡進(jìn)行成像，計(jì)數(shù)了Neubauer計(jì)數(shù)網(wǎng)格中的五個(gè)小格。對(duì)于QUANTOM Tx，細(xì)胞使用QUANTOM總?cè)旧玖线M(jìn)行染色，并使用以下參數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)：LED強(qiáng)度=5，粒徑范圍=0.3-50 μm，檢測(cè)靈敏度=0，解聚等級(jí)=0，圓度=0%。結(jié)果顯示，總細(xì)胞濃度的計(jì)數(shù)結(jié)果之間沒(méi)有顯著差異，但隨著細(xì)胞濃度的增加，血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)結(jié)果變異性較高，而QUANTOM Tx和流式細(xì)胞儀的結(jié)果則更加一致（圖2）。

圖2. QUANTOM Tx、流式細(xì)胞儀和血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)結(jié)果比較。

4 可調(diào)節(jié)的檢測(cè)方案適用于各種形態(tài)和排列方式的細(xì)菌細(xì)胞

為了展示QUANTOM Tx的多功能性，不同種類的細(xì)菌使用QUANTOM總?cè)旧玖线M(jìn)行染色，并通過(guò)QUANTOM Tx進(jìn)行計(jì)數(shù)。QUANTOM Tx能夠在每次計(jì)數(shù)中自動(dòng)捕獲、分析并標(biāo)注多達(dá)20張高分辨率圖像，使得研究人員可以輕松地通過(guò)視覺驗(yàn)證每次計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。以干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）為例，使用以下參數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)：LED強(qiáng)度=5，粒徑范圍=1-50 μm，檢測(cè)靈敏度=0，解聚等級(jí)=7，圓度=0。對(duì)于巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium），使用的參數(shù)為：LED強(qiáng)度=5，粒徑范圍=1-50 μm，檢測(cè)靈敏度=3，解聚等級(jí)=10，圓度=0。更多細(xì)菌種類及其對(duì)應(yīng)的參數(shù)設(shè)置可參見：goo.gl/ixr8kr。如圖3所示，QUANTOM Tx利用解聚功能能夠在緊密排列的桿菌鏈中精準(zhǔn)分辨出單個(gè)細(xì)胞。

圖3. 使用QUANTOM Tx的解聚功能檢測(cè)桿菌鏈中的單個(gè)細(xì)胞。左圖為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei），右圖為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium），解聚等級(jí)分別設(shè)置為7和10。

5 結(jié)論

細(xì)菌是一類極其多樣化的生物，具有多種多樣的形態(tài)、大小和排列方式，這使得自動(dòng)化細(xì)胞計(jì)數(shù)成為一項(xiàng)充滿挑戰(zhàn)的任務(wù)。傳統(tǒng)的菌落計(jì)數(shù)方法不僅耗時(shí)，而且其結(jié)果充其量只能算作一種不可靠的估算。即使是流式細(xì)胞儀，也會(huì)將每個(gè)粒子（無(wú)論是單個(gè)細(xì)胞還是聚集體）都記錄為一個(gè)單獨(dú)的事件。血球計(jì)數(shù)板操作耗時(shí)，并且容易受到操作者間變異的影響。QUANTOM Tx微生物細(xì)胞計(jì)數(shù)儀能夠高效、準(zhǔn)確且快速地對(duì)各種形態(tài)和排列方式的細(xì)菌進(jìn)行定量分析。這使得QUANTOM Tx成為一種重要且必需的工具，可用于樣本中細(xì)菌群體的即時(shí)、實(shí)時(shí)評(píng)估。

使用QUANTOM Tx測(cè)試的部分細(xì)菌列表